400-966-9516
0755-86111281
400-966-9516
新闻中心

干货分享 | 光纤记录技术深度解析,揭开拓展实验研究的奥秘

2021.10.21

分享:

       光纤记录(Fiber photometry)通过时间相关单光子计数(TCSPC)的光纤光学来测量荧光分子在大脑中发出的光信号。基于基本原理,使用直径较小的光纤探头就能实现传输并收集荧光信号,将采集到的发射信号通过二色镜进行光谱分离,并通过滤波器聚焦到探测器上,即可检测出荧光的实时动态变化。


所以光纤记录方法的优势主要在于:

1、植入的光纤探头体积小且柔韧性好,使得周围组织损伤较小;

2、因为植入光纤体积小,方便同时记录多个大脑区域的信号;

3、基于TCSPC的光纤是检测发射光的超灵敏工具,满足在低强度激发光下即可检测荧光,从而减少了光漂白的机会,并延长了记录时间。

 

      目前光纤记录常用于检测钙信号及神经递质信号变化,背后原理是通过给实验动物注射基因编码型的荧光探针/生物传感器,随后通过光纤记录即可检测到对应神经信号的变化。基因编码生物传感器是一类生物分子信号介质,它被整合到细胞的基因组中,然后由细胞的分子机制产生。这些蛋白质结构可以被设计成在化学物质存在或细胞环境变化时改变构象,从而产生荧光信号。


常见的基因编码型的生物传感器根据应用场景主要分为:

1、膜去极化。一旦动作电位(AP)被激活,AP将沿轴突向下传播,并使突触前钮扣对应的膜去极化(−65 mV+40 mV或更大)。这种膜去极化作为神经元激活的分子特征,可以通过遗传编码的电压指示探针(GEVIs)检测;

2、电压门控Ca2+通道激活和输入。当膜去极化发生在突触前活跃区,电压门控Ca2+通道打开,导致Ca2+快速内流。这种升高的细胞质Ca2+浓度(~100-~400nM)的变化可以持续约50-150毫秒,通过基因编码Ca2+指示剂(GECIs)即可检测;

3、膜泡融合/胞外分泌。胞质Ca2+水平升高触发易于释放的突触囊泡的胞外排泄,这些突触囊泡充满了神经递质。在胞外分泌过程中,当突触囊泡与质膜融合时,细胞外介质(pH ~ 7.4)中和囊泡腔(pH ~ 5.5)的酸性pH值,这种中和作用可以通过pH值指标探针检测,如pHluorin

4、神经递质传递。一旦神经递质被释放到突触,它们的功能根据递质类型而异,可以通过神经递质(NT)指标检测,如iAChSnFR dLight。基因编码型乙酰胆碱(ACh)探针iAChSnFR用于检测不同生物样品中的ACh瞬变。它被设计成在胆碱结合时发出荧光,并被证实可用于测量小鼠体内奖励活动中海马ACh传递的反应。dLight是一种基于受体的遗传编码多巴胺(DA)荧光探针。它是通过用环状排列的绿色荧光蛋白(cpGFP)取代DA受体(DAR)的第三个胞内环(Intracellular Loop 3ICL3)的位置而构建的。dLight产生不同的荧光强度对应于DADAR的结合量。

 13.jpg

1所示:光纤记录系统原理和基因编码荧光探针。

A.光纤记录装置和信号处理的原理图。在该模型中,将基因编码的荧光探针病毒注射到腹侧被盖区(VTA),投射的信号从伏隔核(NAc)和前额皮质(PFC)记录下来。

B.四种不同的基因编码型探针及其对应的神经传递分子信号的示意图表示。随着动作电位(AP)的传播,电压门控钙(Ca2+)通道被触发打开,导致快速的Ca2+内流;随即诱导突触囊泡的胞吐,突触囊泡将神经递质(NTs)释放到突触间隙,在突触间隙中神经递质可以与相应的受体结合并激活突触后神经元,这些分子特征可以通过电压指标(GEVIs) Ca2+探针(GECIs) pH值指标探针(pHluorin)NT指标探针(G protein-coupled受体,GCPR)进行检测。示意图非真实比例。


光纤记录实验操作较为简便,目前在神经环路分子机制探究上应用越发广泛,同时越来越多的实验室将光纤记录与其他实验技术进行联合应用。

1、光纤记录与光遗传

       光遗传学是一种以光作为工具特异性激活或抑制神经传递的方法。研究人员经常使用光遗传学以极大的时间精确度来研究确定的神经元亚群对特定行为的影响。但是光照的作用仅仅通过动物行为的检测评估是不完善的,很有可能存在“假阳性”和“假阴性”,且不能排除自然行为的干扰。而光纤记录即可提供足够的证据支撑。光遗传学结合光纤记录的方法使研究人员能够研究特定细胞、它们的投射关系的功能意义。

2、光纤记录与核磁

       一般认为,血氧水平检测(BOLD) fMRI(功能性磁共振成像)通过血管耦合机制与神经传递在时空上相关。为了更深入地了解神经元对BOLD信号的贡献,电生理学技术已被纳入功能磁共振成像研究。虽然这些研究提供了关于神经元环路更具体的信息,但功能磁共振成像(fMRI)所需要的磁场会在电生理信号中产生伪影。

       而近几年的研究中将光纤记录和fMRI相结合,证明了Ca2+峰值和不同大脑区域的BOLD信号之间的联系,同时有文献证明星形胶质细胞Ca2+水平的变化与BOLD信号也有关联。fMRI技术与光纤记录相结合,使fMRI扫描具有细胞分辨率。这种综合技术有潜力

 

14.jpg

2所示:将BOLD fMRI技术与细胞-特异性病毒传递的GCaMP6(一种遗传编码的钙指示剂,GECI)的光学检测技术相结合(Schlegel et al .,Nature protocols(2018)


3、光纤记录与电生理

        目前,电生理学是研究行为与自由行为动物体内神经元动力学关系的金标准分析技术。电生理学允许同时记录数百或数千个细胞、离子通道和神经元活动,电极可以落在单个细胞上,记录细胞内信号变化,或者落在细胞外空间,监测整个大脑区域的电生理信号。它测量的电信号(电流或电位)以高时间分辨率的毫秒级离子通量导出。

        电极阵列记录来自电极尖端附近所有细胞的信号,不能直接区分细胞种类。由于光纤记录方法缺乏较高的时间分辨率,在体电生理学缺乏细胞类型特异性,二者结合有助于高时空分辨率下研究不同的大脑区域特定环路和行为状态。


 15.jpg

    

       R820三色光纤记录系统,可记录GCaMPdLight等绿色荧光指示剂或递质探针,及RCaMPjrGECO1a等红色指示剂或递质探针信号,同时特有的410nm光源用于获取对照信号,有效排除噪声。灵活的TTL信号输入输出设置,更方便拓展实验应用。

 

R820三色多通道光纤记录系统

免费试用


16.jpg

识别上方二维码,快来申请试用吧


【参考文献】

Yuanmo Wang , Emily M. DeMarco , Lisa Sophia Witzel , Jacqueline D. Keighron. (2021) A selected review of recent advances in the study of neuronal circuits using fiber photometry. Pharmacology, Biochemistry and Behavior 201 (2021) 173113.


相关新闻

related news