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技术干货 | 血管紧张素II诱导腹主动脉瘤模型概述

2021.08.13

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么是腹主动脉瘤(AAA)?

       腹主动脉瘤(AAA)是腹主动脉在各种病理因素作用下,以局部扩张向外膨出为主要表现的大血管疾病,主要发生在60岁以上的老人,一旦瘤体破裂,死亡率极高。

腹主动脉瘤(AAA)治疗难点在于缺乏有效的药物用以减缓AAA增长进程和防止瘤体破裂,而目前关于AAA病理生理学的大部分知识主要来自于动物模型的研究。因此,通过AAA动物模型了解发病机制,确定治疗靶点,以及测试潜在药物是突破AAA瓶颈行之有效的方案。


血管紧张素II造模

       较早的研究已经发现c57小鼠皮下输注血管紧张素II(AngII)后,经过解剖发现偶有小鼠发生腹主动脉瘤(AAA)。2000年Daugherty A等人[1]首次报道,采用缓释泵皮下输注血管紧张素II连续28天,剂量为0.5或1μ g/min/kg,能够在载脂蛋白E缺陷(ApoE-/-,高脂血症小鼠)小鼠中诱发腹主动脉瘤(AAA)。此后,采用此模型进行的研究已有数百项,是目前化学诱导AAA最常用的造模方式。AngII输注模拟AAA的炎症发生过程,能够促进肾上腺主动脉扩张,动脉粥样硬化,巨噬细胞蓄积,以及血栓形成。


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AngII模型手术操作

(a)ApoE-/-小鼠称重后麻醉,按1000ng/kg/min的剂量计算每只小鼠所需Ang II的量并灌满缓释泵;

(b)小鼠麻醉后以俯卧的体位固定在手术操作台上,将颈背部皮毛消毒,并横向剪开约1cm长的开口,分离皮下组织,形成空隙,将装有Ang II的微量渗透泵植入背部皮下;

(c)缝线缝合皮肤切口并进行表面消毒;

(d)待小鼠苏醒后将其放回鼠笼继续常规饲养28d以待腹主动脉瘤发育。


RWD植入式缓释泵一次性埋置最长28天持续给药


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01 模型特点

  1. 通过AngII诱导的动脉瘤模型手术简单,不需要经过复杂的开腹手术和主动脉剥离手术;

  2. 该模型具备人类AAA的一些关键特征,例如与男性AAA多发相似,雄性小鼠比雌性小鼠更容易通过输注AngII诱发动脉瘤;

  3. AngII诱导的动脉瘤表现出显著的炎症、细胞外基质重塑和血栓形成相关基因的上调,与人类患者相似;

  4. AngII诱导的小鼠动脉瘤也常发生破裂。

  5. 需要指出的是,血管紧张素II诱导的动脉瘤也存在不足之处,比如AngII诱导的动脉瘤主要发生在肾上主动脉或胸主动脉,而人类患者最常受影响的部位是肾下主动脉。


02 模型修改

ApoE-/-等转基因老鼠需要经过长时间杂交选配等基因操作,获取相对困难,而相比于先天血脂异常的转基因鼠,普通C57BL/6小鼠对血管紧张素II的促动脉瘤作用具有抗性,研究显示C57BL/6小鼠AngII灌注后,仅39%能诱发AAA,这限制了AngII模型的应用。因此研究者们围绕如何使普通C57小鼠对AngII诱导的AAA易感,对模型进行了许多修改。较为成熟的是:

  1. AngII+BAPN联合法[3]:雄性C57BL/6小鼠采用缓释泵皮下输注AngII 4周,剂量1μg/kg/min,并在输注AngII的前2周,在饮用水中加入β-氨基丙腈(BAPN),剂量为0.625 mg/mL诱导AAA模型,瘤体破裂几率约为12%。

  2. TGF-ß抗体中和法[4]:雄性C57BL/6小鼠采用缓释泵皮下输注AngII 4周,剂量1μg/kg/min,同时小鼠每周两次腹腔注射10mg/kg剂量的抗TGF-ß抗体,能诱导80%的C57小鼠出现AAA, 并有40%的小鼠发生动脉瘤破裂。


03 评估小鼠AAA模型

常用的评估动脉瘤成模的方法包括形态测定法、组织学、免疫组织化学、Western Blotting和实时定量PCR等,AAA的严重程度可以根据动脉瘤的最大直径、内侧弹性蛋白纤维断裂和细胞外基质降解的程度以及主动脉炎症的程度来分级衡量。

  • 瘤体直径分析:分离小鼠主动脉时,用数码相机拍照,可用ImageJ软件测量腹主动脉外最大直径。腹主动脉相对扩张率按以下公式计算:相对扩张率=动脉瘤最大直径/假手术(当相对膨胀率超过1.5时,定义为AAA)。

  • 形态学分析:形态学采用分级量表(1-4型)进行评估。I型,主动脉肾上区管腔扩张,无血栓形成;II型,肾上区血管组织重塑,并常伴有血栓形成;III型,II型基础上具备明显球根状,并含有血栓;IV型,在主动脉的肾上区有多个动脉瘤,其中有血栓,有些瘤发生重叠。


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  • 组织学分析:用苏木精-伊红和弹性蛋白Van Gieson (EVG)对腹主动脉切片进行染色,对主动脉中的弹性蛋白降解进行双盲评分。弹性蛋白降解的评估和分级(1-4分)根据以下标准: 1分,弹性蛋白降解小于25%;2分,25 - 50%的弹性蛋白降解;3分,50 - 75%弹性蛋白降解;4分,降解率大于75%。

  • 分子生物学评估:采用免疫组化方式使用相应的抗体染色巨噬细胞或T淋巴细胞进行炎症的严重程度分析。Western Blotting和ELISA法用于相关蛋白检测,实时定量PCR对mRNA进行差异表达分析等。

  • 超声成像:高分辨率超声可以提供详细的形态学评估,能够准确定义AAA大小、是否存在壁内血肿、腔内血栓等,还可以评估血管壁的生物力学特性,如周长应变或脉搏波速度等。超声成像能进一步了解AAA在体内的发育阶段,对深入了解AAA的发病机制具有较大价值。


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AAA小鼠模型中常用的评估方法[5]


【参考文献】

1. A. Daugherty, et al. Angiotensin II Promotes Atherosclerotic Lesions and Aneurysms in Apolipoprotein E-deficient Mice. J Clin Invest. 2000; 105: 1605-1612

2. J. L. Poulsen, et al. Animal Models Used to Explore Abdominal Aortic Aneurysms: A Systematic Review. Eur J Vasc Endovasc Surg. 2016; 52(4): 487-499.

3. H.A. Cooper, et al. Targeting Mitochondrial Fission as a Potential Therapeutic for Abdominal Aortic Aneurysm. Cardiovasc Res. 2021; 117(3): 971-982.

4. Y. Wang , et al. TGF-β activity protects against inflammatory aortic aneurysm progression and complications in angiotensin II–infused mice. J Clin Invest. 2010; 120(2): 422-32.

5 J. Golledge, et al. Mouse models for abdominal aortic aneurysm. Br J Pharmacol.2020.




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