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MCAO造模手术过程中常见问题及解决方案

2020.10.21

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1.     如何在活体小鼠颈部区分颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉,线栓从哪个位置进入最合适,为什么会在这个位置最合适。

答:1)从颈正中切口,向下分离组织,在气管旁侧可看到一根较粗的血管,即为颈总动脉,沿着颈总动脉向上分离,可看到Y字型的分叉,其中靠近气管侧较浅的血管为颈外动脉,远离气管侧较深的为颈内动脉,其中颈外动脉一般在颈内动脉上方,颈内动脉一般分布在叫较深层的地方。

2)从颈外动脉插入线栓更合适: 能更好的实施再灌注,因为颈总动脉没有被结扎,拔线后血液还可以从颈总动脉进入大脑。 从颈外动脉进栓可以将颈外动脉直接剪断,但不会对大脑造成缺血性损伤,若从颈总动脉进栓,会导致一侧大脑半球的缺血性损伤,而不是局部缺血性脑损伤。

 

2.     从颈总开口入栓,会遇到什么问题,为什么现在比较少见这种造模方法。

答:1)若从颈总动脉进栓,造成的结果不仅仅是大脑中动脉的阻塞,而是整个·动脉的阻塞,会导致整个大脑半球的损伤,而不是局部损伤。这样手术风险较大,不提倡使用。

2)若颈总动脉被结扎,不能很好的实施再灌注。

3)从来没有任何课题组提倡从颈总动脉开口插入线栓。

 

3.     常规线栓包含哪些材质

答:常规线栓包含单丝尼龙线及外层包被的硅胶。

 

4.     大鼠可以用那些仪器检测脑血流,这些仪器都需要如何操作?

答:

现在文章中越来越多的利用激光散斑血流成像系统检测小鼠头颅脑血流,其操作相对简单,成像分辨率相对较高(最高可达2048*2048

1)        激光散斑血流灌注视频系统:激光散斑血流监测视频系统的诞生使以前不可能监测的微循环现象成为可能,血流变化宛如电影一般展现,可以对每个区域、特定时间内血流灌注进行数据分析,不需要在颅骨上打洞。

仅需剪开头皮,就可成像观察脑血流。适合批量、高质量实验。

2)激光多普勒血流仪:

a)     首先是确定监测位置:这个取决于实验动物的品系和体重、以及缺血模型的种类。切开皮肤,清理颅骨表面筋膜,激光多普勒的穿透深度为1mm左右,皮肤、毛发的存在会完全影响信号,如果是做大脑中动脉缺血模型,检测部位一般在同侧冠状缝后1mm,中线外1-4mm的位置。

b)    麻醉的深浅、麻醉药的选择、其它手术操作都可能影响动物的状态(注意是影响动物的状态,不是影响仪器的监测),如果要得到高质量的数据需要把实验条件标准化,并且对动物的血压进行监测(血压会显著影响微循环血流灌注量)。

c)     尽可能将探头固定在颅骨上。

d)    缺血前、缺血瞬间、缺血后再灌注的血流量要连续监测,由于微循环血管床分布有空间差异性,间断性描记缺血前后血流量会降低实验数据的可信度。

操作相对复杂,不适合批量实验

5.     小鼠和大鼠如何避免线栓进入翼腭动脉,如果需要结扎,如何结扎,需要活结还是死结?

答:大脑中动脉阻塞后,翼颚动脉中的血液可能会回流到大脑中动脉中,造成阻塞不完全,将翼颚动脉结扎可以避免这样的事情发生,同时还可以避免手术过程中线拴进入翼颚动脉。翼颚动脉的供血区域有很多的侧枝循环,所以在结扎翼颚动脉时使用活结和死结都可以。

 

6.     为何需要结扎颈外动脉?不结扎是否可行?

答:插线栓前需要结扎颈外动脉的上端并将其从下方剪断,将颈外动脉的断端翻转过来,便于线栓顺利进入与之相连的颈内动脉。如果不结扎颈外动脉直接剪断的话会造成出血,影响操作视线;如果不剪断颈外动脉的话,线栓就无法进入颈内动脉,所以必须结扎颈外动脉。

 

7.     一般线栓可以进入多长?

答:27g-30g的小鼠进拴的长度一般为9.5mm-10.5mm260g-280g大鼠进拴的长度一般为18-19mm。线栓插入长度要依据动物体重适当调整。

 

8.     样本量如何确定具体数值?

答:总体思路:样本量不能太少,必须通过一定数量的重复观测才能把研究总体真实的客观规律性显示出来,并且可以对抽样误差做出客观地估计。但重复观测次数越多(即样本含量越大)试验所要消耗的人力、物力、财力和时间越多,可能会使试验研究成为不可能。而且,样本含量过大还会增加控制试验观测条件的难度,有可能引入非随机误差,给观测结果带来偏性。

考虑因素:(1)  动物生存率和动物模型成本;(2)     实验过程中可能造成的死亡。

具体的样本量选取过程:

(1)  首先确定要观测的指标,实验复杂度;(2)   确定四个数值:希望发现的最小差异δ,如两总体均数之差、两总体率之差;总体标准差σ的估计值;检验水准α,一般取0.05II类错误的概率β,一般取0.10或者0.20(3)   设计预实验,根据预实验的结果对所需样本数进行估计;(4)      如果预实验和正式实验的规范一样严格,那么预实验的实验动物数可以计入最终的实验样本总数。

 

9.     大鼠mcao模型对应人类缺血性脑卒中急性期恢复期,就7d14d28d是否有相关文献依据?

答:大鼠MCAO模型3d-7d对应人类缺血性脑卒中急性恢复期。

Jin R, Zhu X, Li G. Embolic middle cerebral artery occlusion (MCAO) for ischemic stroke with homologous blood clots in rats[J]. JoVE (Journal of Visualized Experiments), 2014 (91): e51956.

Ahmad M A, Najmi A K, Mujeeb M, et al. Protective effect of guggulipid in high fat diet and middle cerebral artery occlusion (MCAO) induced ischemic cerebral injury in rats[J]. Drug research, 2016, 66(08): 407-414.

 

10.  再灌注如何操作,线栓在造模后期一般如何处理?

答:MCAO模型60-120min后,将线拴从颈内动脉向外拔出一段距离,使得颈总动脉的血液能够顺利回流到大脑中动脉中。造模后期线拴可以留在小鼠体内不做处理,但是要注意固定线拴的线头需要扎紧,避免出血。剪掉栓塞线多余部分,逐层缝合创口。

线栓在造模后期一般先用酒精消毒,避免可能的颅内感染。

 

11.  老年鼠判断标准,如何确保老年鼠体重稳定在280g左右,目前研究老年鼠的文献多么,老年鼠研究最主要困难是什么,对老年鼠研究有什么建议

答:老年鼠的判断标准:大鼠、小鼠的年龄在18-24个月以上。

如何控制体重在280g左右:饮食控制即可。280g可以控制每天摄食10-13g并随时监控。

目前对于老年鼠的研究:文献较多,研究类别也较丰富。由于小鼠寿命短,老年鼠易得,常用于研究衰老的起因和机理,神经细胞的凋亡规律,药物对学习和记忆功能、认知障碍的影响,抗衰老的作用,恢复老龄鼠的功能,包括神经干细胞增殖分化功能,以及一些免疫功能的研究。

老年鼠研究中的主要困难:饲养成本高,每一只老年鼠的饲养周期很长,购买费用高;在实验中,由于老年鼠的各器官已经老化,对老年鼠进行手术会导致死亡率高。

对老年鼠研究的建议:由于老年鼠的机能老化与人体许多功能很相似,建议多做老年鼠实验,尤其是老年鼠脑缺血模型的研究。

 

12.  永久损伤与短暂性损伤操作区域与判定标准区别

答:操作区域都是阻塞大脑中动脉。永久性缺血损伤是在脑缺血后不进行拔栓,而短暂性损伤在脑缺血60min90min或者120min后有一个拔栓血液再灌注的过程。

判断标准:1)测脑血流:使用激光多普勒血流仪测定小鼠两侧大脑的血流量。永久性损伤的缺血大脑血流不会恢复,比正常对侧要低很多。短暂性损伤的缺血大脑再灌注后血流能够恢复到对侧的80%左右。2TTC染色:永久损伤的缺血性大脑损伤面积大,短暂性损伤的缺血性大脑损伤区域固定在皮层和纹状体之间。3)行为学永久损伤的小鼠死亡率很好,行为学无法恢复。短暂性损伤的小鼠在缺血后期(14-28天)行为学能够在一定的程度上恢复正常。

 

The difference in operating area and standard between permanent damage and transient damage in MCAO

A: the area of operation is blocked the middle cerebral artery. Permanent ischemic injury is a process of thrombectomy without thrombectomy after cerebral ischemia, while the transient injury is a process of thrombectomy and blood reperfusion after cerebral ischemia for 60min, 90min, or 120min.

1) measurement of cerebral blood flow: the blood flow in both sides of the brain of the mouse was measured by using the RFLSI Ⅲ. Blood flow to the ischemic brain does not recover after permanent injury and is much lower than the opposite side. In transient ischemic brain reperfusion, blood flow can be restored about 80% of the contralateral volume.

2) TTC staining: the area of ischemic brain injury with permanent injury is large, while the area of ischemic brain injury with transient injury is fixed between the cortex and striatum.

3) behavior: the mortality of permanently damaged mice was very good, and behavior could not be recovered. The behavior of mice with transient injury returned to normal to a certain extent in the late stage of ischemia (14-28 days).

 

13.  如何提升MCAO成功率,一般常规成功率是多少

答:1)麻醉:首先从麻醉小鼠起要保证小鼠的麻醉状态平稳,良好的开端是成功的第一步。所以需观测小鼠的呼吸如胸廓起伏程度保证麻醉程度合适。应监视心率,

呼吸频率和体温这三项基本指标。麻醉期间至少每15 分钟记录一次以上参数。

正常监控参数:呼吸频率应为55-100 次呼吸/分钟;麻醉期间呼吸频率下降50%可能是正常的;呼吸模式可用于监测麻醉,应呼吸均匀平缓而不应深而慢或快而浅。

脉搏频率应为300-500 /分钟。麻醉下的正常温度范围为36.5°C 37.5°C

粘膜颜色应为粉红色或鲜红色,不应为淡白色或深褐色。正常的毛细管再填充时间(CRT<2 秒。

2)手术操作:

分离颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉时一定要注意勿损伤迷走神经,并将血管周围的结缔组织剥离干净,为线栓插入做好准备。同时注意勿伤及血管以防止大出血所致的死亡。颈总动脉上剪口是手术关键步骤之一,眼科剪要锐利,剪口时剪刀与血管正上方约成60°角,剪口不宜太大,否则血管容易断裂造成实验失败。以不超过颈总动脉壁上1/4为宜,但也不宜太小,否则入线困难。尼龙线栓的制备是MCAO手术中又一关键环节,线栓头端需修剪打磨圆钝,防止头端过于锋利而刺破血管,引发蛛网膜下腔出血而死亡。此外,线栓预先浸蘸肝素钠,一般认为可减少阻塞期间动脉血栓的形成。手术中,需尤其注意线栓连续缓慢推进时遇到轻微阻力即止,插线深度一般在18mm左右时可抵达大脑中动脉起始处或至大脑前动脉,线栓在血管内切忌顿挫式推进,否则可能由于无法体察轻微阻力而造成入线过深;当然也需防止因插线深度不足而导致线栓不能有效地阻断大脑中动脉血流。术后缝合时,需注意勿碰触线栓,因为线栓轻微外移有可能造成MCA血流阻断失败。缺血结束后,在实施再灌注时,需注意回撤线栓一定要轻柔,切忌动作过猛或直接将线栓拔出而造成出血。另外还应注意术中对大鼠的保温,以及术后食物和水的供给。

3)线栓

线栓制作 确定线栓包裹的大小直径,一般是6 号尼龙线,总长约1.5cm,硅胶头约2mm;线栓要均匀,捋直,不要大头,头重脚轻,不要太粗或太粗;线栓头部一

定要先烧一下,圆润,否则易脱落和戳破。进栓过程 要确定线栓的进线深度,进线10mm 左右( 9.5-10.5 ), 太深会穿破分叉口进到更深的地方,戳破颈内里面的血管,太浅又无法达到阻塞的目的;只有正好在颈内颈外颈总动脉三叉口的部位才能完成中动脉的阻塞。进栓前线栓先用肝素浸泡处理,防止血流凝固造成阻塞。

成功率因操作者的熟练程度而异,一般在训练一个月后,成功率约为80%-85%

 

14.  造模完毕出现TTC染色面积偏小,具体原因是什么,如何避免这个问题出现

答:原因:

a)     建立的模型不稳定,操作不规范;

b)    线栓头较小,无法完全导致大脑中动脉阻塞;

c)     线栓长度不足,没有达到中动脉处;

d)    TTC试剂使用次数过多;

避免出现问题:

a)     控制线拴头的大小,大约为2mm

b)    27g-30g小鼠线拴的长度一般为9.5mm-10.5mm260g-280g大鼠线拴的长度一般为18-19mm

c)     需要使用多普勒血流仪实时监测脑血流,保证模型的稳定性。

 

15.  为何动物行为学上出现了脑梗死,但是TTC染色却无结果

答:1TTC试剂过期无效;

2TTC操作时不规范,没有在室温下避光染色,染色时间过短,没有用盖玻片压;

3)小鼠的代偿功能较强,没有明显的缺氧缺血;

4)在行为学上出现脑梗死,不代表模型时成功的,归因于操作不规范,没有使用多普勒血流仪器实时监测或者激光散斑检查。

 

16.  为何在MCAO造模栓塞会出现同侧肢体异常,还是对侧肢体异常,一般的行为学标准有哪些?

答:MCAO造模后一般出现对侧肢体异常,因为一侧大脑控制身体对侧的行为活动。

MCAO造模后的行为学评估有两种:

1Zea Longa  Zea Longa法为504分制:0分,无神经损伤;1分,提尾时对侧前肢内收屈曲(轻度神经损伤)2分,爬行时向对侧旋转(中度神经损伤)3分,站立或爬行时,向对侧倾倒(重度神经损伤)4分,无自主活动伴意识障碍。

2)改良的Garcia JH评分  该方法从大鼠自主运动、体态对称性、前肢伸展功能、攀爬运动、身体双侧触觉、双侧胡须碰触反应等6个方面评估大鼠神经功能损伤的程度。分值为318分,数值越大,神经功能损伤越轻,18分为正常(如下表)

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17.  麻醉对造模有什么影响,一般那种造模方法最常规。

答:麻醉对造模的影响:

1)麻醉能够使得小鼠丧失运动功能,无疼痛反应,有利于术者的操作。

2)麻醉后的小鼠丧失吞咽功能,气管容易淤积痰液,造成小鼠呼吸不畅,严重的会引起窒息。咯痰的小鼠黏膜发白,呼吸微弱。术者可以使用软吸管定时帮助小鼠吸出痰液,避免该情况的发生。

3)麻醉后的小鼠体温会降低,术者可以使用加热垫维持小鼠的体温在37度左右。

最常规的麻醉方法:目前最常规的麻醉方法是异氟烷气体麻醉,诱导麻醉的浓度为3-4%,维持麻醉的浓度为1.5-2.5%

 

18.  线栓进入深度与小鼠体重和年龄相关么?如何判断是否进入正确位置

答:线栓进入深度与小鼠体重和年龄相关。  

如何判断正确的深度:用激光散斑,激光多普勒血流仪,如果是血流下降,下降到20%左右,那就进去到正确位置,如果血流不下来,就不在正确位置。一般小鼠线栓深度为9.5-10.5mm,实际操作时结扎线较松弛,轻轻地一点点往里插栓线,发现栓线被插进去又被弹出来一点点时提示终点,往往把弹出来的一点点再插进去或者插到插不动时才把线扎紧。

 

19.  如何配置肝素钠溶液

答:纯的肝素10mg能抗凝65-125 ml血液(按1mg等于125单位 , 10 -20单位能抗1ml血液)。但由于肝素制剂的纯度高低以及其保存时间长短不等,因而其抗凝效果也不相同。一般可配成1%肝素生理盐溶液,用时取0.1毫升于试管内, 100 ℃ 烘干,每管能抗凝5-10ml血液。在动物实验作全身抗凝时,一般剂量为:大白鼠2.5-3.0mg / 200-300g体质量。肝素可改变蛋白质等电点,因此当用盐析法分离蛋白质作蛋白质各部分的测定时,不可采用肝素。

 

20.  术后小鼠出现不饮食问题,这是什么导致的,如何避免这个问题

答:

1)   手术不熟练是最主要的问题,或是手术操作不当,使得颈部神经坏死,无法进食。因此手术过程尽量轻柔;

2)    线拴插入过深:导致大脑缺血严重,影响小鼠正常摄食。手术过程中需要检测血流,选择合适的进拴深度;

3)    麻醉剂过量:导致小鼠苏醒后状态不佳,精神萎靡,食欲不振。手术时应减少麻醉剂量,随时检测小鼠的生命体征;

4)    疼痛及失血过多:手术过程中操作不当使得小鼠失血过多,小鼠因为疼痛和虚弱难以进食。

5)   在术前,术中和术后都需要做好消炎措施,注射适量的消炎药物。

 

21.  SD大鼠MCAO模型,仅仅出现纹状体梗死,而无皮层梗死,请问是什么原因,如何预防。

答:纹状体比大脑皮层对缺血更为敏感,缺血30分钟内仅在纹状体梗塞,而缺血超过一个小时才会同时损伤纹状体和皮层。如果造模后发现仅出现纹状体梗死可能是线拴的深度不够,或者是缺血再灌注的时间过短,可以通过调整线拴深度或增加缺血时间来预防。

 

22.  进线栓注意事项,是否有角度要求呢?怎么确保不是插入MCA起始端呢?

答:进线时,保证栓线向屋顶方向弯曲,一般都能将线插入大脑中动脉,而不会进入翼腭动脉。可以通过测量两侧大脑的血流来判断是否正确阻塞大脑中动脉。

 

23.  经常遇到插入11-12mm没有感受到阻力,拔出来再插入10mm又遇到阻力?

答:手术不熟练是最主要的问题。另外,可能插入时可能戳破脑内的血管,随后迅速形成血栓,再次插入时由于血栓的存在产生阻力。

 

24.  发现小鼠会出现眼睛瞎的情况?有时候第二天或者第三天才瞎?有时候会有白色浑浊液体

答:小鼠眼睛瞎的原因:

1)           切记,应该在手术前给小鼠涂眼药膏;

2)           栓线进入了翼颚动脉,翼颚动脉的末端是眼动脉;

3)           线拴戳破了血管导致颅内出血,使得眼球供血不足;

4)           手术过程中失血过多,导致小鼠眼球发白;

5)           栓线堵住了MCA近端靠下的给小鼠眼神经供血的动脉。

可能线拴没有完全堵死血管,眼球只是部分供血不足,随着时间的推移眼球缺血加重,才会出现眼睛瞎的症状。眼球缺血后组织开始坏死,白色浑浊液体可能是炎性渗出物。

 

25.  轻轻遇到阻力后系上线栓,术后眼睛变白而且瞎,解剖无颅底出血,然后1-2天就死亡呢?

答:切记,应该在手术前给小鼠涂眼药膏;脑缺血太严重。另外,可能小鼠因为脑缺血及眼球的炎症反应双重伤害导致死亡。

 

26.  白眼球是什么原因造成的呢,是否插入太深或者颅内出血

答:

1)           没有在手术前给小鼠涂眼药膏;

2)           栓线进入了翼颚动脉,翼颚动脉的末端是眼动脉;

3)           线拴戳破了血管导致颅内出血,使得眼球供血不足;

4)           手术过程中失血过多,导致小鼠眼球发白。

 

 

 

26.png

           38℃ 1h               39℃ 1h

 

27.  我们买的加热垫设置为37℃,室温25℃做实验,堵塞1h,发现没有梗死,38℃出现梗死,好像半影区很明显梗死大小不稳定,39℃梗死是否太大呢?

答:手术过程中保证小鼠体温在 37°C,缺血时的温度会影响梗死体积的生成,温度过低,会由于低温保护作用,造成梗死灶体积过小或每只模型梗死体积不一致;而温度过高会加重脑损伤,导致梗死体积过大,动物容易死亡。

 

28.  术后应该怎样具体护理才能降低小鼠死亡率?比如打什么抗生素和使用什么止痛药等等

答:1)术后抗感染:手术后大多数动物死亡会源于术后感染,所以抗感染是重要的护理环节。首先切口周围应严格用碘伏消毒,消毒范围不应低于1.5 cm;同时,从术后当天开始,每天腹腔注射4万单位青霉素,连续注射7;术后生活的笼具垫料也应进行严格的消毒灭菌,垫料需每天更换一次。

2)术后镇痛:术后切口强烈的疼痛,也是实验动物死亡因素之一。在缝合伤口后,可以选择性的以 2.5 mg/kg标准于小鼠尾静脉注射曲马多,以达到镇痛目的。

3)术后饮食:MCAO术后1周内,为死亡高发期,其中一个重要的原因就是术后自主进食不佳。术后应采用流食,可 以喂养奶粉,或用10%蔗糖代替。如若1天内小鼠仍没有进食行为,可以采用灌胃处理。

4)环境温度:术后饲养的环境温度应在 27°C±0.5°C,不宜过高,过高会出现灌注流速太大引起的脑出血,湿度为 70%±5%,通风良好,避免噪声及动物间的相互干扰。

 

29.  有时候术后第2-3天死亡,解剖没有发现颅底出血,有哪些可能的原因呢

答:首先要找出死亡原因,解剖死亡大鼠的脑,先看是否有蛛网膜下腔出血,如有出血,表明死因是进拴太深,以后注意插线深度;如无出血,则还要再看是否有严重的大脑半球水肿,如脑水肿严重,则表明死因是脑缺血时间太长,需要缩短缺血时间;如既无出血,又无明显的脑水肿,那就要注意动物状态或生活环境是否太差。

 

30.  术后第2天发现解剖小鼠发现大脑背面出血是手术伤到哪里了吗?

答:大脑背面出血可能是蛛网膜下腔出血,可能是线拴插入过深。

 

31.  异氟烷麻醉手术插入线栓堵塞时死亡?拔线栓时死亡?

答:插栓时死亡原因:

a)     麻醉剂量过深;

b)    窒息:呼吸道分泌物增多,操作时压迫小鼠的气管及分离血管时损伤迷走神经,导致小鼠窒息死亡。

c)     手术过程中失血过多:包括分离颈部血管时出血、血管破裂出血、血管夹闭不全出血、线栓头脱落出血、反复多次插入线栓出血等;

拔栓时死亡原因:

a)     线栓已经插破血管,拔线时导致大出血;

b)    拔栓时颈外动脉没有结扎好,导致大出血;

c)     再灌注会加重小鼠的大脑损伤,小鼠无法承受。

 

32.  术后声音沙哑?

答:可能是控制声音的脑区缺血导致小鼠声音沙哑


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