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多巴胺和5-羟色胺的超灵敏性分析

2019.05.31

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本信息介绍

多巴胺和5-羟色胺水平的体内监测,广泛使用微透析技术与HPLC-ECD结合。然而,使用这种方法,微透析液中多巴胺和5-羟色胺的水平却变化较大,有时低至nmol/L水平。尤其在小鼠研究中,研究人员使用较小的活性膜长度,导致多巴胺和血清素水平降低。在这里,我们为大家介绍一种快速、超灵敏的方法,这种方法,可以用于分析多巴胺和血清素水平,并提高通量、节约分析时间。

 

众所周知,提高灵敏度的一种方法是使用微孔柱,以这种方式获得色谱图,会产生大的溶剂前峰,而这种溶剂前锋会干扰保留时间短的峰。色谱柱的负载能力可低至2μL。这种情况对于微透析应用来说并不理想。

 

使用普通的3或5μm粒子ODS柱的问题如下:

  1.  获得的色谱图显示大量未知峰,可能会干扰目标峰。

  2. 通常较早的保留时间会导致峰值更尖锐。

  3. 快速洗脱也会增加与其他峰值干扰的机会。

  4. 电化学检测器在检测具有溶剂前峰干扰的早期保留时间的峰时存在问题。


因此,同时最小化分析时间和最大化灵敏度的理想条件如下:

  1. 及时洗脱

  2. 从溶剂前峰明确分离信号峰

  3. 信号峰值周围的峰值较少

  4. 低噪音水平和稳定的基线


在考虑到以上因素后,瑞沃德代理的Eicom公司产品给出了通过改善多巴胺和5-羟色胺的分离条件的解决方案。创新的PP-ODS色谱柱采用2μmODS规格,亲水性化合物保留率低,采用4.6 ID x30 mm色谱柱填料,可实现更高的灵敏度和通量。

分析条件


HPLC-ECD

Eicom HTEC-500

Eicom PP-ODS(4.6ID x 30 mm)

流速

500μl/ min

应用电压

+400 mV vs. Ag / AgCl

工作电极

Eicom WE-3G

时间常数滤波器

1.5秒

系统温度

25℃下


应用实例


在该研究中使用雄性Sprague-Dawley大鼠(250-300g)。用戊巴比妥钠(50mg / kg腹膜内)麻醉大鼠并固定在立体定位装置上。用于微透析探针的脑内导管插管(AG-4,Eicom)植入额叶皮质(导管尖端位于A = + 3.2,L = 2.8,V = 1.0),一般来说,这里多巴胺水平非常低。一天后,通过植入的引导插管将微透析探针(2mm活性膜长度,AI-4-02 Eicom)插入额皮质中,并以自由移动的条件以2.0μL/min灌注Ringer’s溶液。将微透析液收集到注射器样品环(20μl)中5分钟,然后通过在线注射器EAS-20自动注射到HPLC-ECD系统HTEC-500中(图1)。


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多巴胺和5-羟色胺的高通量分析。样品通过在线自动注射器自动注射。总注射体积为10μl(2μl/ min×5min)。上述多巴胺峰对应于98 fg。


通过在纹状体中进行药理学研究来评估峰识别(引导尖端定位A = + 0.2,L = 3.0,V = 3.5mm)。在获得基础水平后,通过微透析探针施加10μM河豚毒素或通过腹腔注射50mg / kg B.W. pargyline。


结果讨论


每个色谱图在5分钟内完成,然后允许注射下一个样品。在低压力下,在6.5-10MPa的范围内连续使用一个柱超过六个月。通过增加流速,分析速度可以变得更快。基于从实际样品分析(图2)获得的色谱图而不是标准样品,最低检测限为约30 fg(s / n = 3)。使用此方法确定检测限是更现实的,因为未知峰可能导致干扰。多巴胺和血清素明显地与压缩的溶剂前峰和其他未知的可检测峰分离。这可能是由于离子对试剂的高浓度和PPODS柱对亲水性物质的低保留能力导致的离子排斥的结果。通过PP-ODS柱与石墨电极(其噪声水平提高超过玻璃碳电极的s / n水平的两倍)的组合实现了稳定的背景。微透析样品可注入体积为40μl,最佳加载体积为20μl。在宽的浓度范围内确认峰响应的线性(图3)。


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如图4和图5所示,通过大鼠纹状体中的定性微透析研究也证实了峰的同一性。河豚毒素减少了多巴胺外排,pargyline增加了多巴胺和血清素水平。这些数据与以前的报告一致。应用在线自动注射器来简化微透析研究有助于研究人员减少因样品处理造成的不一致的可能性。问题出现在如何防止多巴胺和血清素的自动氧化。我们比较了含有40mM乙酸的微透析液样品中多巴胺和血清素的水平,发现使用在线自动注射器时无差异。


微信图片_20191009182921.jpgHTEC-500和PP-ODS色谱柱的组合提供了更简洁的分析方法,灵敏度更高,可缩短采样周期。


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