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病理组织固定中4类难点问题及应对方法

2022.01.07

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组织固定是组织病理学中的基本操作步骤,只有经过固定,才能完成随后一系列的制作,直到切片的最后完成。但在日常的病理制片中,经常发生因固定不好出现各种问题,本期我们总结了4个组织固定常见问题并提供参考方法,期望能给广大病理工作者日常工作带来些许启发。

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一、固定液使用时有哪些基本原则和注意事项?
  1. 选择合适容器。一般容器的容积是组织的10~15倍以上,以瓶口较大的为宜,便于标本放取。

  2. 固定时间要足够。根据标本体积大小不同,固定时间应有所不同,组织越大越厚,固定时间应越长。一般4~12小时或更长。在温箱内将固定液稍加温,可使固定作用加快而缩短固定时间。

  3. 固定液要足量。一般应为组织体积的5~10倍,多比少好。标本最好悬浮于固定液中,漂浮于固定液之上或沉于底部都不利于固定液渗入。标本块多时,固定时不应重叠。不要先将标本放入容器后再注入固定液,以免标本粘附,固定不均匀。新鲜标本应及时固定,否则或因组织陈旧,或因固定不当,使组织原有结构消失而影响观察。

  4. 对于某些需要制作神经染色和酶反应等组织的固定,要求较一般严格,组织大小、固定时间、温度的适当都应慎重考虑,尤其是对于酶反应的固定液,一般都要置于冰箱,在低温的条件下进行固定。固定不好,是得不到满意的切片和合乎标准的反应效果的。

  5. 任何固定液对人体都有损害作用,因此固定液的容器必须密闭,以防挥发损伤器官和眼睛,忌用手与固定剂直接接触,以免损伤皮肤。

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二、病理标本固定不良该如何补救?
  1. 把已包埋的固定不良的组织重新放入石蜡中融蜡,使组织周围多余的蜡去除

  2. 把已除去石蜡的组织放入二甲苯Ⅰ(或环保脱蜡剂)中30分钟,二甲苯Ⅱ30分钟,以去除组织内含有的石蜡。

  3. 把经过两道二甲苯的组织重新逐级放入乙醇。

  4. 无水乙醇Ⅰ→无水乙醇Ⅱ→95%乙醇→80%乙醇中各20分钟,此过程应注意各级乙醇应是初次使用,而且不可重复使用,以免已脱蜡的组织又重新沾上乙醇中含有的蜡。

  5. 如为胃镜取得小标本,组织已干枯,应在以上程序后水化,应放1%~2%冰醋酸内使组织软化后重新水洗,水洗时间视标本大小确定。

  6. 把经过各级乙醇浸泡得组织重新放入70%甲醛乙醇溶液中固定。

  7. 把经过二次处理的组织和下一批标本一起放入脱水机内常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片。

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三、在免疫组化技术中固定液应如何选用?

免疫组化染色标本在取材后需立刻投于固定剂中,使组织和细胞的蛋白质凝固,终止内源性或外源性酶反应,防止组织自溶或异溶,以保持原有结构和形态,原位保存抗原,避免抗原失活或弥散。常用固定液:

  1. 醛类:甲醛应用最广,优点是形态结构保存好,穿透性强,组织收缩少,缺点是放置过久可氧化为甲酸,使溶液pH降低,影响染色。注意缩短固定时间,降低固定温度(4℃),为此组织块不宜过厚。改用中性缓冲甲醛溶液,以pH7.2~7.4浓度0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10%甲醛固定液,减少固定液pH的变化。

    戊二醛优点穿透性强,微细结构保存好,但对抗原有一定影响,常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。

    多聚甲醛(常用4%)可用于免疫电镜,也可用于免疫荧光染色。主要检测组织内一些性能较弱的抗原特别是细胞表面抗原,对组织穿透性好,组织收缩小,对大多数抗原物质保持较好,特别是对脂肪和各种酶的固定效果更好,适用于免疫组织化学染色,但固定时间宽容度小,以24小时以内为宜。

  1. 醇类:最常用乙醇,使细胞内蛋白、糖类发生沉淀,穿透性强、抗原性保存好,但脱水性强,易引起组织收缩变硬,影响切片质量,所以固定时间不宜过长(2小时内)。乙醇使蛋白变性的作用轻,固定后可再溶解;染色过程中,温育时间长,抗原可流失而减弱反应强度。

  2. 丙酮对抗原性的保存好,但脱水性更强,较少用于组织标本,但细胞爬片常用丙酮固定。

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四、特殊组织的固定有什么需要注意的吗?
组织固定方法注意事项
骨组织

关键步骤:把骨中的钙质脱掉

方法一:固定后脱钙

方法二:固定脱钙同时进行

(注:先脱钙后固定的方法不推荐!)
非特殊需要,切忌使用酸性固定剂,如乙酸、苦味酸、三氯乙酸等,这些固定剂会使骨组织加速膨胀,破坏骨组织结构,使制片难以进行
淋巴结

厚度为0.3cm的淋巴结组织块,采用10%中性缓冲甲醛溶液固定的时间以12小时为佳

厚度为0.2cm的组织块经6小时固定能获得较满意的制片效果
新鲜的淋巴结样本应尽快进行取材和固定
肌腱组织推荐采用Bouin液12-24小时,流水冲洗20分钟苦味酸(picric acid)不会使组织硬化,有软化肌腱的作用,是该组织固定的良好固定剂
烧伤皮肤采用A.G.M固定液,可使烧伤皮肤固定均匀,因有冰醋酸故渗透力较强,不会引起二次收缩变形
眼球需采用眼球特殊固定液固定,西京固定剂既可保持较快的穿透作用,又避免了组织的硬化和过度收缩,可保留视网膜结构的完整


以上就是本期小沃与大家分享的组织固定问题及参考方法,您还有什么组织固定问题,欢迎在微信后台留言,我们将持续为您答疑。


【参考文献】

  1. 病理技术大讲堂1001问-病理技术操作疑难点解惑答疑. 席越,陈军主编.人民卫生出版社


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