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干货分享 | 光纤记录实验手术操作流程,超详解析值得收藏!!

2021.10.18

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        光纤记录系统作为常用的研究动物神经元活动与行为关系的重要工具,对于研究特定神经环路在不同行为范式中的功能具有重要意义。本文将着重介绍光纤记录实验手术所需器材,手术步骤以及注意事项,助力实验数据准确性的提升。


实验设备和材料 

        异氟烷麻醉系统、立体定位仪、数码显微镜、电极拉制仪、微量注射泵、剃毛工具、手术刀、眼科镊、眼科剪、棉签、碘伏、3%双氧水,AAV病毒、陶瓷插针、颅骨钻、钻头(0.8mm)、颅钉(M1.0xL2.0mm)、螺丝刀(45*1mm)、生理盐水、牙托粉水(义齿基托聚合物,自凝型)、红霉素眼膏、抗生素等。


术前准备

01 确定目标脑区坐标

确定目标脑区位点通常有两种策略:

通过使用立体定位图谱,寻找目标脑区具体位置,读取目标脑区深度,矢状、冠状坐标,最终确定目标脑区的三维坐标。

通过阅读参考文献,获取方法中涉及目标脑区的坐标。文献中坐标常用标注:

AP:anteroposterior,前囟前后;

ML:mediolateral,中缝左右;

DV:dorsoventral,颅骨(硬脑膜)平面向下。

*需要注意:文献中坐标选取的Z轴参考点:包括Bregma点、脑膜表面、颅骨表面的Z轴读值



02 器具消毒、仪器检查

       实验前使用酒精擦拭手术器械,检查各种实验耗材是否准备完整。检查立体定位仪,确保定位仪刻度置零,可以正常工作。


03 实验动物准备

       选取实验动物检查其健康状况。

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动物手术

01 动物麻醉及固定

a、小鼠称重。

b、在异氟烷诱导盒中麻醉小鼠(4%,1 L / min)。

c、将小鼠嘴部放在麻醉面罩中。

d、将小鼠门齿扣在适配器齿棒上,并使用适配器将小鼠固定于立体定位仪上,异氟烷浓度调整为0.5-1%。

e、麻醉深度可通过对脚趾捏合无反应(监测脚趾捏合反应)来确认,手术期间每20min一次。

f、剃掉从眼睛到耳朵后面的毛发。

g、用棉签蘸少量碘伏清洁头部。

h、在头皮表面下注入0.1 ml利多卡因,以提供局部镇痛作用。

i、保护眼睛避光:涂抹红霉素眼膏。

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02 暴露颅骨

a、从前到后(眼睛之间到颅骨后部)做切口。

b、用蘸有生理盐水的棉签擦拭切口。

c、找到并标记Bregma(前囟点)位置。

d、确保头骨干净(没有血液,毛皮或组织)并且干燥(使用干燥的棉签吸生理盐水或血液)。

e、将连接好玻璃电极的微量注射泵夹持到定位仪上。

f、调节颅骨水平:玻璃电极针尖接触Bregma点,将该点设定为原点,而后测量Bregma点左右两侧旁开2.3mm处颅骨的高度差,小于0.03mm则认为左右颅骨水平,大于0.03mm则需要调节耳杆的高度来调整水平,前后方向测量Bregma点和Lambda点的高度差,也需小于0.03mm,若大于0.03mm则上下调整鼻夹的高度(注意:移动颅骨后需要重新定Bregma点)。

g、标记目标位置。

h、在目标标记点处用颅钻进行开颅并挑开硬脑膜。此外还需钻两个预留孔,用于埋植颅钉。如果钻孔过程发生出血,使用棉签清洁血液,然后使用一块可吸收的海绵来止血。

i、用盐水浸湿的海绵覆盖开颅部位。


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03 病毒注射

a、从冰箱中取出病毒。

b、设置微量注射泵参数(例如吸取体积400nL,速度为800nL/min,模式调为吸入Withdraw)吸取病毒,使其尖端接触Bregma点并设定原点。

c、取走开颅部位湿海绵。

d、将玻璃电极针移动至目标位点上方,然后下针至目标位点(下针过程保持匀速缓慢),设置注射泵参数(体积400nL,速度40nL/min,模式调为泵出Infuse),开始注射病毒。

e、注射完成后静置10min,10min后将微量注射器抬起。

f、瑞沃德R480玻璃微电极注射泵搭配立体定位仪,对脑部可精准进行病毒或示踪剂注射。


04 埋植颅钉

       颅钉(小螺丝)植入深度约0.5mm左右,避免过深压迫大脑,过浅固定不牢固。固定颅钉的预留孔需离光纤埋植的位置远一些,防止颅钉埋好之后留下的空间太小,导致光纤不好埋植。颅骨钻孔完成后,还需清理颅骨表面的颅骨碎屑,并用生理盐水清洗,保证颅骨表面清晰干净。


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05 陶瓷插针植入

a、在病毒注射后,从脑立体定位仪上取下注射泵。

b、将光纤插针用夹持器固定到脑立体定位仪上。

c、固定光纤之后需要用光纤尖部接触Bregma点,重新移动至目标位点上方(光纤插针应位于钻头产生的窗口上方)。

d、将光纤插针下降到适当的DV坐标,高于病毒注射位置200-300μm。

e、用牙科水泥固定光纤。注意:牙科水泥轻轻涂抹在光纤纤维的底部周围。

f、待水泥完全凝固后,小鼠转移至饲养笼中单独饲养,术后监测健康情况。


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光纤记录实验

        待2-3周钙荧光病毒表达后,将光纤与小鼠头部陶瓷插针连接,使用光纤记录系统采集动物在行为学实验中大脑的钙荧光信号,通过分析软件处理钙荧光信号数据,并结合行为学视频对动物的行为进行分析。


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        光纤记录实验手术中所需器材、手术步骤和注意事项已全部讲解,后续我们还有更多光纤记录干货,请持续关注哦~


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