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实操技巧:大小鼠脑组织冰冻切片操作步骤

2021.07.02

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      在对脑组织进行免疫染色或原位杂交等实验前,需对实验动物组织(如大小鼠)进行切片处理,冰冻切片常常是研究人员的首选。原因是对比石蜡切片,冰冻切片无需脱水、透明、浸蜡等复杂的前处理过程,细胞可避免抗原活性损伤,操作又快又简单。


小鼠脑组织冷冻切片操作步骤

(*大鼠操作步骤与小鼠相同,本文以小鼠为示例)


1 小鼠灌注固定

鼠经麻醉后开胸暴露心脏,经左心室先快速灌注生理盐水约50ml至流出液变清亮,换4%多聚甲醛继续灌注约100ml至组织变硬。


2 取材脱水

      剥离脑组织,置广口瓶中用4%多聚甲醛在4℃条件下后固定12-24小时。将标本转入10倍体积的30%蔗糖溶液(用4%多聚甲醛配制),4℃脱水至组织沉底,成年鼠脑通常需要2天,幼年不带颅骨的鼠脑通常需要1天,带颅骨则需更久。


3 设置冷冻切片机温度

(*实操步骤以瑞沃德Minux®冷冻切片机为示例)

箱体温度设置为-20℃,样品头温度设置为-22℃(可按实际切片情况调整)。

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4 冷冻样品包埋制备

(1)取出脱水后的脑样品,用生理盐水清洗后,吸水纸吸干。

(2)然后开启快速制冷,将样品托放速冻位点,涂一层OCT包埋剂,覆盖样品托凹槽,用冷锤压平,制作一个基座平台。

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(3)将鼠脑腹侧向下平放在基座中心,从鼠脑中央均速滴入OCT至鼠脑完全覆盖。若鼠脑位置变动,可用镊子调整,冷冻至OCT完全凝固。


注意事项:
鼠脑表面必须完全干燥,表面遗留30%蔗糖将导致切片时OCT与样品分离。OCT中不能有气泡,特别是样品附近的气泡会影响冰冻切片效果。


5 冷冻切片

(1)将放在箱体内预冷的刀片安装在刀架上。

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(2)松开样本头上的锁杆,根据可视指针标识可以快速精准调节样本头角度,角度调节好后重新锁紧锁杆。

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(3)顺时针扳动样本头左侧手柄可将样品托固定在样本头上,卡上即可。

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(4)将修块厚度设置为50-100μm,去除多余的OCT(此时不需要放下防卷板),直至接近样品,通常能看到一点肉色透出。修片的同时可再次调整角度,获得合适的切面。

(5)根据实验需求设置切片厚度。RNA原位杂交用贴片通常设为12-20μm;免疫组化用漂片通常设为30-50μm,贴片通常为20-30μm。

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(6)放下防卷板,微调后方黑色旋钮调整防卷板前后位置,使得切下的切片平滑进入防卷板之下的间隙并被压平整。

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(7)若采取漂浮收片,需预先准备加有PBS的24孔或48孔板。使用小毛笔将脑片转移到PBS中,按顺序收取。板子的盖子和侧面均应标注,避免盖板分离,样品混淆。若采取贴片,需使用带正电荷的防脱玻片,将脑片平整的贴在玻片上。

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6 注意事项

(1)检查刀片和防卷板有无豁口,若有需避开或更换。

(2)调节距离时避免快速撞击防卷板或刀片,避免产生豁口。

(3)贴片前注意检查玻片的洁净程度,若有明显杂质附着,需要更换或处理后再使用。

(4)预先在玻片有色端做好标注,以免出错。

(5)切片时若出现脑片碎裂,说明样品温度过低;若出现卷片粘连,说明样品温度过高。应相应调整箱体和样本头温度,优化切片效果。

(6)冷冻切片机有自动除霜和自动消毒功能,不能将冷冻切片机当作冰箱保存组织标本。


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